Il DNA mitocondriale (mtDNA), a differenza di quello nucleare che è contenuto all'interno della cellula, si trova all'interno dei mitocondri, organuli che si trovano nel citoplasma. La sua analisi è lunga e laboriosa e rimane un metodo da utilizzare in aggiunta e non in sostituzione degli STR. E' molto utile nei casi di accertamento di maternità, in quanto rappresenta l'eredità in linea materna; viene trasmesso solo dalla madre ai figli, indipendentemente dal sesso: quindi fratelli della stessa madre avranno lo stesso DNA mitocondriale. In genetica forense ciò è fondamentale come contributo nello studio di casi complessi o particolari.
Esso è costituito da una molecola circolare a doppio filamento lunga 16.569 bp.
Le regioni che vengono sequenziate sono: HV1, HV2 e HV3. I risultati ottenuti, per convenzione, sono descritti utilizzando come riferimento la prima sequenza completa di mitocondrio "Cambridge reference sequence".
Diversi sono i problemi dell'analisi del DNA mitocondriale: uno è il rischio di contaminazione esogena e, l'altro, la presenza di eteroplasmia (vale a dire la contestuale presenza, nella stessa cellula, di molecole di mtDNA di sequenze differenti).
Tale test risulta essere utile in quei campioni biologici che hanno DNA degradato o scarso, nonché è di notevole supporto nei casi di accertamento di maternità complessi o deficitari.
